配制環(huán)凱培養(yǎng)基必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為其缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

 

　　補充因子是代替血清的各種因子的總稱。環(huán)凱培養(yǎng)基必須補加3-8種因子，胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白是必須補充因子，其他多數(shù)為輔助作用的因子。按其功能不同，補充因子可分為五類：

 

　　1、結(jié)合蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白與細(xì)胞上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合是細(xì)胞獲取鐵元素的主要來源。白蛋白與脂類、激素、維生素、金屬離子和生長因子結(jié)合后可調(diào)節(jié)上述物質(zhì)在無血清培養(yǎng)基中活性的作用，此外，由于牛血清白蛋白一般添加量比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細(xì)胞免受機械損傷。

 

　　2、激素和生長因子：很多細(xì)胞用無血清培養(yǎng)時需要加入激素，如胰島素、生長激素、胰高糖素等。胰島素是重要的細(xì)胞存活因子，與細(xì)胞上的胰島素受體結(jié)合后可促進RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡。此外，雌二醇、孕酮等也是無血清培養(yǎng)基中常添加的補充因子。

 

　　3、酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細(xì)胞的目的。

 

　　4、貼壁因子：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖粘連蛋白、膠原蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖粘連蛋白主要促進來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。

 

　　5、其他補充因子：一些細(xì)胞培養(yǎng)使用的無血清培養(yǎng)基還需要補充微量元素、維生素、脂類等低分子量物質(zhì)。